Szanowni Państwo| Zakład Biologii Molekularnej |
 |
 |
 |
Zakład Biologii Molekularnej tworzą dwie Pracownie, które realizują swój niezależny profi l badawczy. Pracownia Kwasów Nukleinowych realizuje tematy związane z adaptacją metod biologii molekularnej dla potrzeb diagnostyki chorób nowotworowych. Tematyka realizowana w tej Pracowni ma charakter tzw. Translational research i jest w przeważającej części odpowiedzią na zapotrzebowanie ze strony Klinik Centrum Onkologii. Grupa badawcza kierowana przez dr Fabisiewicz współpracuje z większością Klinik Centrum. Pracownia Biochemii realizuje tematykę związaną z badaniami nad mechanizmami regulującymi ekspresję genów. Przedmiotem szczególnego zainteresowania grupy badawczej kierowanej przez dr Grzybowską jest rola 3’ niekodującej części mRNA w tkankowo-specyfi cznej ekspresji genu.
Pracownia Kwasów Nukleinowych
Badania prowadzone w Pracowni koncentrują się wokół problemów związanych z wczesnym wykrywaniem komórek nowotworowych w płynach i wydzielinach ustrojowych. Opracowano wielomarkerowy test (MART 1, tyrozynaza i uMAGE) oparty o technikę RT-PCR, pozwalający na wykrycie komórek czerniaka krążących w krwioobiegu i obecnych w płynie limfatycznym uzyskiwanym po usunięciu węzła wartowniczego lub po terapeutycznej limfadenektomii. Test ten jest obecnie wykorzystywany do analizy przeżyć w grupie pacjentów w III stopniu zaawansowania czerniaka skóry, u których wykonano limfadenektomię terapeutyczną. Otrzymane wyniki potwierdzają przydatność testu do przewidywania przebiegu choroby.
Opracowano trzymarkerowy test pozwalający na wykrywanie komórek raka piersi w krwioobiegu. Analizie poddano przydatność trzech markerów: cytokeratyny 19 (CK19), mammaglobiny (hMAM) i podjednostki â ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (â-hCG). Stwierdzono, że test dwumarkerowy podwyższa czułość detekcji komórek raka piersi w porównaniu z testem jednomarkerowym. Wykazano również, że dodanie trzeciego markera nie podnosi istotnie czułości testu. Prowadzone są badania nad wykrywaniem i monitorowaniem choroby resztkowej u chorych na chłoniaki grudkowe. Markerem obecności choroby jest obecność translokacji t(14:18) wykrywana za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (QRT-PCR). Celem tych badań jest ustalenie, czy oznaczenie ilości komórek z translokacją może posłużyć do monitorowania skuteczności leczenia chorych na chłoniaki grudkowe oraz czy wykorzystanie techniki QRT-PCR jest przydatne do ustalenia kryteriów remisji molekularnej w chłoniaku grudkowym. Uzyskane dane wskazują, że metoda QRT-PCR pozwala na obserwację zmian w populacji komórek nowotworowych podczas leczenia. Na podstawie uzyskanych danych zasugerowano wartości wskazujące na podwyższone ryzyko nawrotu choroby. Równocześnie wskazano jednak, że brak obecności komórek t(14;18) we krwi nie świadczy o tym, że chory ma całkowitą remisję kliniczną. Komórki nowotworowe mogą bowiem przetrwać zarówno w szpiku kostnym, węzłach chłonnych, jak i płynie mózgowo-rdzeniowym. Z tego powodu znacznie
właściwsze jest śledzenie obecności komórek z translokacją t(14;18) nie tylko w krwi, ale również
w szpiku kostnym. Wykazano, że gen anhydrazy węglanowej 9 (CA9) ulega transkrypcji i translacji zarówno pierwotnych płaskonabłonkowych guzach raka sromu, jak również w komórkach przerzutujących do regionalnych węzłów chłonnych. Ponadto dowiedziono, że stan niedotlenienia charakteryzuje płaskonabłonkowe guzy raka sromu i wpływa na potencjał przerzutowy. Przerzutujące do regionalnych węzłów chłonnych komórki raka sromu wykazują ekspresję markerów hipoksji – CA9 i transportera glukozy 1 (GLUT1). Stan węzłów chłonnych jest czynnikiem ryzyka wystąpienia wznowy raka sromu. Jednakże badania, w których przy użyciu technik immunohistochemicznych oceniano stan pachwinowych węzłów chłonnych, wykazały znaczną liczbę rozpoznań fałszywie ujemnych. Wykorzystując te dane opracowano czuły i specyfi czny test oparty o dwustopniową reakcję RT-PCR wykrywający obecność CA9 mRNA Test ten pozwala na identyfi kację komórek raka sromu w węzłach chłonnych. Cechuje go czułość wyższa niż badanie histopatologiczne z barwieniem hematoksyliną i eozyną. Realizowany jest również projekt dotyczący badania metabolizmu telomerów. Analiza tempa skracania się telomerów oraz replikacyjnego czasu życia komórek wyprowadzonych z zespołu przedwczesnego starzenia wykazała, że proces starzenia się organizmu człowieka nie jest uwarunkowany zmianami długości telomerów. Wykazano również, że w jednym z histologicznych podtypów nowotworów jąder (w nasieniakach) obserwuje się charakterystyczne jedynie dla komórek płciowych zjawisko zachowania homeostazy długości telomerów. Przeprowadzone dodatkowo badania ekspresji genu polimerazy DNA â oraz TP53 potwierdziły hipotezę płodowego pochodzenia nowotworów jąder. Badania nad modelami patogenezy nowotworów jąder wskazują, że polimorfi zm powtórzeń CAG w DNA polimerazie ã może być związany z ryzykiem rozwoju tych nowotworów.
Wykazano, że stan zapalny towarzyszący chorobie nowotworowej może być przyczyną fałszywie pozytywnych wyników w detekcji przerzutujących komórek metodą RT-PCR. W ramach działalności Studium Doktoranckiego w Pracowni prowadzone są badania nad obecnością mutacji w genach KIT i PDGFRA oraz badaniem przyczyn oporności pierwotnej i wtórnej w GIST w kontekście skuteczności leczenia imatinibem. Prowadzone są również badania nad rolą zmian epigenetycznych w raku jelita grubego oraz nad związkiem pomiędzy metylacją i zmianami mutacyjnymi w genach związanych z naprawą DNA a skutkami leczenia glejaków mózgu lekiem alkilującym nowej generacji- temozolomidem.
Pracownia Biochemii
W pracowni kontynuowane są prowadzone od lat badania nad biologiczną rolą 3’ niekodującej części informacyjnego RNA (3’UTR). Układem modelowym są 3’ UTRy dwóch różnych tran skryptów (1,4 i 4,0 kz) polimerazy DNA â szczura. We współpracy z Zespołem kierowanym przez prof. W. Krzyżosiaka z Instytutu Chemii Bioorganicznej w Poznaniu ustalono, że w 3’UTR krótkiego (1,4 kz) transkryptu obecne są trzy moduły strukturalne (M1, M2 i M3). Moduł M2 jest silnie konserwowany ewolucyjnie i charakteryzuje się silną strukturą typu spinki do włosów. Został wytypowany jako potencjalny motyw regulatorowy. Analiza przeprowadzona w układzie re porterowym z lucyferazą, wykazała złożony wpływ modułu M2 na ekspresję. Regulacja przebiega na poziomie potranskrypcyjnym. Wykazano, że insercja motywu M2 powoduje destabilizację transkryptu. Jednocześnie pomiar na poziomie białka nie wskazuje na obniżenie ekspresji. Transkrypt reporterowy z insercją zmutowanej sekwencji nie wykazywał destabilizacji, co wskazuje na rolę badanego motywu w regulacji stabilności mRNA. Wysoka ekspresja na poziomie białka wskazuje na dwustopniowy mechanizm regulacji ekspresji i kompensację spadku poziomu mRNA poprzez podwyższenie eksportu z jądra i/lub przyspieszenie translacji. Wykorzystując system trójhybrydowy umożliwiający analizę oddziaływań RNA-białko poszukiwano białek oddziałujących z z modułem M2. Znaleziono wiele klonów, ale tylko jeden okazał się klonem pozytywnym. Kodował on C-końcowy fragment białka Hax-1. W warunkach in vitro (doświadczenia z rekombinowanym białkiem – współpraca prof. Csaba Koncz z Instytutu Maxa Plancka w Kolonii) uzyskano potwierdzenie oddziaływania Hax- 1 z motywem M2. Wynik uzyskany w systemie trójhybrydowym potwierdzono dwoma niezależnymi metodami: poprzez sprzęganie wywołane ultrafi oletem i analizę SDS-PAGE, oraz metodą wiązania kompleksów RNA-białko na fi ltrze nitrocelulozowym, pozwalającą na określenie stałych dysocjacji kompleksów. Ustalono także, że interakcja zachodzi wyłącznie gdy białko Hax-1 występuje w postaci dimeru. Izolacja transkryptu genu Hax-1 doprowadziła do sklonowania 7 wariantów alternatywnego składania, różniących się włączaniem pierwszych 2 intronów i częściowym wycinaniem eksonu 2. Przeprowadzono analizę ekspresji wariantów w różnych tkankach szczura, wykazując, że żaden z wariantów nie jest tkankowo-specyfi czny. Wykazano jednocześnie różnice w poziomie ekspresji tran skryptów Hax-1 w różnych tkankach szczura (szczególnie wysoką ekspresję zaobserwowano w jądrach). Analiza biochemiczna (frakcjonowanie) wykazała obecność białka Hax-1 w mitochondriach, ale także w jądrach komórkowych. Frakcjonowanie jąder przeprowadzone dwiema niezależnymi metodami (wysoko- i niskosolną) wykazało obecność tego białka we frakcji macierzy jądrowej. Taką lokalizację białka Hax-1 wykazano po raz pierwszy. Obecność białka Hax-1 w jądrze potwierdzają obserwacje w mikroskopie fl uorescencyjnym, przeprowadzone z zastosowaniem fuzyjnego białka HAX-1 z białkiem GFP.
Obecnie prowadzone są badania zmierzają do opisania ludzkich wariantów alternatywnego składania genu HAX-1.
Realizowane aktualnie projekty grantowe
Projekt badawczy własny nr 2P05C 058 27, „Diagnostyka molekularna czerniaka skóry:
Badanie obecności komórek nowotworowych w wysięku chłonnym u chorych po terapeutycznej limfadenektomii za pomocą dwumarkerowego testu metodą RT-PCR oraz korelacja z klinicznym przebiegiem choroby”. Termin realizacji koniec 2007 r.
Projekt badawczy własny N301 004 32/0437, „Badanie funkcji i lokalizacji izoformy antyapoptycznego białka Hax-1 w komórkach szczura, termin realizacji maj 2010.
Projekt badawczy własny N401
Wybrane publikacje
Fabisiewicz A, Kulik J, Ober P, Brewczyńska E, Pieńkowski T, Siedlecki JA. Detection of circulating breast cancer cells in peripheral blood by a two-marker reverse transcriptase- of polymerase chain reaction assay. Acta Biochim Pol 2004; 54: 135-42.
Ruka W, Rutkowski P, Nowecki ZI, Kulik J, Nasierowska-Guttmejer A, Siedlecki JA. Detection of melanoma cells in lymphatic draiage ofter lymph node dissection in melamoma patients by using two-marker reverse transcriptasepolymerase chain reaction assay. Ann Surg Oncol 2004; 11: 988-7.
Kowalewska M, Radziszewski J, Kulik J, Barathova M, Nasierowska-Guttmajer A, Bidziński M, Pastorek J, Pastorekova S, Siedlecki JA. Detection of carbonic anhydrase 9-expressing tumor cells in the lymph nodes of vulvar carcinoma patients by RT-PCR. Int J Cancer 2005; 116: 957-62.
Grzybowska EA, Sarnowska E, Konopiński R, Wilczyńska A, Sarnowski TJ, Siedlecki JA. Identifi cation and expression analysis of alternative splice variants the rat Hax-1 gene. Gene 2006; 371: 84-92.
Kowalewska M, Chechlińska M, Markowicz S, Kober P, Nowak R. The relevance of RT-PCR detection of disseminated tumour cells is hampered by the expression of markers regarded as tumour-specifi c in activated lymphocytes. Eur J Cancer 2006; 42: 2671-4.
Tysarowski A, Fabisiewicz A, Paszkiewicz-Kozik E, Kulik J, Walewski J, Siedlecki JA. Usefulness of real-time PCR in long-term follow-up of follicular lymphoma patients. Acta Biochim Pol 2007; 54: 135-42.
Rutkowski P, Nowecki ZI, Dębiec-Rychter M, Grzesiakowska U, Michej W, Woźniak A, Siedlecki JA, Limon J, Dobosz AJ, Kąkol M, Osuch C, Ruka W. Predictive factors for long-term effects of imatinib therapy in patients with inoperable/ metastatic CD117(+) gastrointestinal stromal tumors (GISTs). J Cancer Res Clin Oncol 2007; 133: 589-97.
Sarnowska E, Grzybowska EA, Sobczak K, Konopiński R, Wilczyńska A, Szwarc M,.Sarnowski TJ, Krzyżosiak WJ, Siedlecki JA. Hairpin structure within the 3’UTR of DNA polymerase â mRNA acts as a posttranscriptional regulatory element and interacts with Hax-1. Nucleic Acid Res 2007 [Epub ahead of print].
Lasota J, Jerzak vel Dobosz A, Wasąg B, Woźniak A, Kraszewska E, Michej W, Ptaszyńki K, Rutkowski P, Sarlomo- Rikala M, Steigen SE, Schneider-Stock R, Stachura J, Chosia M, Ogun G, Ruka W, Siedlecki JA, Miettinen M. Presence of homozygous KIT exon 11 mutations is strongly associated with malignant clinical behavior in gastrointestinal stromal tumors. Lab Invest 2007 [Epub ahead of print].
|
